Данное исследование проведено для определения токсического воздействия четырех дезинфицирующих веществ, а именно сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого, на рыб и патогенные бактерии: Аэромонад (Aeromonas sp.), Флюоресцирующую псевдомонаду (Pseudomonas fluorescens) и Эдвардсиеллы (Edwardsiella sp.), флавобактерии (Flavobacterium sp.). Стандартным методом в аквариуме определили смертельную концентрацию дезинфицирующих веществ для мальков вида Labeo rohita. Смертельная концентрация сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого для рыбы составляла 0.75 мг/л, 7 мг/л, 6 мг/л и 0.5 мг/л при экспозиции 21,4 часа, 18 часов, 9,5 часов и 1,4 часа, соответственно. Метиленовый синий в концентрации 4 мг/л и 5 мг/л препятствовал росту Pseudomonas fluorescens, а концентрация, равная 6 мг/л, подавляла развитие Aeromonas sp.. Сульфат меди (CuSO₄) оказался эффективен только против Edwardsiella sp. в концентрации 10 мг/л и 8 мг/л. Малахитовый зеленый в концентрации 1 мг/л подавлял рост всех четырёх участвующих в эксперименте бактерий. Перманганат калия (KMnO₄) не продемонстрировал никаких сдерживающих эффектов на бактерии даже в концентрации 30 мг/л.

Введение

В Бангладеш большое количество рыбы ежегодно умирает в различных рыбных хозяйствах в связи со вспышками бактериальных и грибковых болезней. Основными бактериальными болезнями в Бангладеш являются аэромоноз, бактериальная геморрагическая септицемия, заражение эдвардсиеллами и столбиковая болезнь (бранхиомикоз и плавниковая гниль), которые вызваны подвижными аэромонадами (Aeromonas sp.), флюоресцентными псевдомонадами (Pseudomonas fluorescens), эдвардсиеллой (Edwardsiella sp.) и бактериями вида Flavobacterium, соответственно. В качестве профилактических и контрольных мер по остановке заболеваний рыбоводы и владельцы рыбозаводов используют различные виды дезинфицирующих средств. Сульфат меди (CuSO₄), перманганат калия (KMnO₄), метиленовый синий и малахитовый зеленый являются известными химическими веществами, используемыми для уничтожения внешних паразитов и грибковых болезней в рыбе. Сульфат меди (CuSO₄) эффективный альгицид, но он оказывает токсическое воздействие на многие виды рыб.

Факторы, влияющие на токсичность меди, связаны с такими характеристиками качества воды, как твердость, щелочность, жесткость и растворенный органический углерод. Увеличение этих параметров качества воды приводит к снижению токсичности меди и последующему увеличению допустимой дозы для рыб, тогда как для контроля над ростом водорослей требуются более высокие концентрации.

Перманганат калия (KMnO₄) токсичен для бактерий и фитопланктона и обычно используется для нейтрализации рыбных токсинов, таких как туботоксин и антимицин. Использование метиленового синего против бактериальных, грибковых и паразитических инфекций выявило, что это средство является эффективным в отношении поверхностных грибковых инфекций рыб. Кроме того, оно убивает растения и бактерии биофильтра в аквариуме. Лекарство может использоваться в качестве альтернативы малахитовому зеленому для контроля роста грибка, если лечение последним веществом невозможно из-за непереносимости у рыбы. Метиленовый синий безопасен для икры рыб и мальков, поэтому его используют для предотвращения грибковых инфекций. Повторно вещество может применяться для уничтожения внешних простейших, таких, как Ихтиофтириоз (Ichthyophthirius), Хилодонелла (Chilodonella) и Костия (Costia). Метиленовый голубой оказался эффективен для снижения бактериальной обсемененности у мальков Нильской тиляпии (Orechromis niloticus). Малахитовый зеленый часто использовался в борьбе с внешней инфекцией, которую вызывают простейшие, и грибковыми болезнями с 1993, но из-за его негативного воздействия на рыбу и водные организмы вещество пока еще не внесли в список ветеринарных препаратов. Однако в Бангладеше рыбаки не знают надлежащих доз дезинфицирующих веществ и часто применяют дезинфицирующие средства в слишком больших дозах, что может привести к интоксикации и даже гибели рыбы. К сожалению, до сих пор не проведено систематического исследования для решения этих проблем.

Учитывая факты, данное исследование проведено для определения токсического воздействия четырех дезинфицирующих веществ, а именно сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого, на рыб и патогенные бактерии: Aeromonas spp., Pseudomonas fluorescens, Edwardsiella spp. и Flavobacterium spp.

Материалы и методы

Определение смертоносных концентраций для рыбы:

Определение смертельной концентрации дезинфицирующих веществ: сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого проводилось на рыбе в аквариуме, емкость которого составляла 30 литров воды. Отдельный аквариум наполнили 6 литрами фильтрованной воды. Раствор сульфата меди (CuSO₄) подготовили в концентрациях 0.25 мг/л, 0.5 мг/л, 0.75 мг/л, 1 мг/л, 2 мг/л, 3 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 10 мг/л, 20 мг/л и 30 мг/л, в то время как концентрации перманганата калия (KMnO₄) составляли 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л. Концетрации метиленового синего составляли 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, 30 мг/л, 40 мг/л и 50 мг/л. Дозы малахитового зеленого равнялись 0.1 мг/л, 0.25 мг/л, 0.5 мг/л, 0.75 мг/л и 1 мг/л. Концентрации установили с помощью измерения дезинфицирующих средств электрометром и затем растворили в требуемом объеме воды.

В каждый аквариум поместили одно дезинфицирующее вещество в определенной концентрации. Шесть мальков лабео длиной в 8-10 см находились в каждом аквариуме, их состояние отслеживали на регулярной основе.

Определение эффектов, сдерживающих рост числа бактерий

Бактерицидное влияние веществ на четыре рода патогенных бактерий у рыб, а именно аэромонаду, флюоресцентную псевдомонаду, эдвардсиеллу и флавобактерию, определяли в искусственных условиях. В начале эксперимента отобранные штаммы культивировали в питательном бульоне в течение 24 часов в шейкер-инкубаторе с температурой 25°С с поворотом 100 об/мин. Приблизительно 50 микролитров бактериального бульона поместили на пластину с питательным агаром, находящуюся внутри камеры с однонаправленным потоком воздуха, где культуру бактерий распределили по пластине с помощью вращений L-образной стеклянной палочки по часовой и против часовой стрелки. Стеклянную палочку простерилизовали в 70% растворе спирта и пламени горелки. Растворы сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого в разной концентрации подготовили с использованием обработанной в автоклаве дистиллированной воды. Затем 1 мл каждого раствора разлили в отдельные микроцентрифужные пробирки, а 50 микролитров каждого раствора поместили на пластину с агаром, содержащую посевную культуру. На каждой пластине отмечали концентрацию раствора и номер культуры. Затем эти пластины находились в инкубаторе при 25°С в течение 12 часов. После 12 часов работы инкубатора организм считали чувствительным к веществу, если существовала зона полного ингибирования вокруг инокулированного раствора. Организм считали устойчивым к веществу, если зоны ингибирования не наблюдалось.

Результаты и обсуждение

Аквакультура является важной экономической отраслью Бангладеша. Однако распространение различных болезней, включая бактериальные инфекции, ограничивает производство рыбы в рыбоводческих хозяйствах. Для профилактики болезней рыб и борьбы с ними традиционно используются различные дезинфицирующие средства. Однако эти дезинфицирующие средства токсичны и даже способны привести к гибели рыбы. В настоящем исследовании выявлены смертельные концентрации сульфата меди (CuSO₄), перманганата калия (KMnO₄), метиленового синего и малахитового зеленого для мальков вида роху: 0,75 мг/л, 7,00 мг/л, 6,00 мг/л и 0,50 мг/л за 21,4 часа, 18,0 часов, 9,5 часов и 1,4 часа соответственно. Bills (1974) сообщил о значении ЛК50 малахитового зеленого в размере 2 мг/л для молоди радужной форели.

В искусственных условиях проанализировано подавляющее воздействие четырех дезинфицирующих веществ на четыре основные патогенные бактерии у рыб. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что бактерии флюоресцентная псевдомонада и аэромонада не смогли размножаться при концентрациях метиленового синего, равных 4 мг/л или 5 мг/л и 6 мг/л, соответственно. Рост Эдвардсиеллы прекратился в растворе CuSO₄ с концентрацией 10 мг/л и 8 мг/л. Флавобактерию признали устойчивой к сульфату меди (CuSO₄), перманганату калия (KMnO₄) и метиленовому синему во всех концентрациях, но чувствительной к малахитовому зеленому в концентрации 1 мг/л. Перманганат калия (KMnO₄) не смог остановить развитие ни одного из четырех видов бактерий во всех испытанных концентрациях, в то время как малахитовый зеленый препятствовал росту всех бактерий в концентрации 1 мг/л. Только метиленовый синий оказался способен уничтожить флюоресцентную псевдомонаду и аэромонаду в безопасных для рыб концентрациях.

Таким образом, болезни рыб, связанные с флюоресцентной псевдомонадой и аэромонадой, можно вылечить с помощью метиленового синего без каких-либо негативных последствий для рыбы. Два важных алгицида, сульфат меди (CuSO₄) и перманганата калия (KMnO₄) оказались неэффективны при концентрации ниже летальной. Сульфат меди (CuSO₄) оказался эффективен против эдвардсиеллы в дозах 10 мг/л и 8 мг/л., которые намного превышают смертельные концентрации (0,75 мг/л за 21,4 часа). Таким образом, сульфат меди (CuSO₄) не должен использоваться для профилактики и лечения болезней рыб, вызванных эдвардсиеллой. Перманганат калия (KMnO₄) неэффективен в борьбе с любым из этих четырех типов бактерий даже при концентрации 30мг/л. Таким образом, не следует рассматривать перманганат калия (KMnO₄) для лечения бактериальных болезней рыбы.

Резюме и выводы

Эксперимент проведен для обнаружения смертельных концентраций для рыбы и антибактериального воздействия четырех распространенных дезинфицирующих средств в Бангладеше. В настоящем исследовании установлено, что некоторые дезинфицирующие средства, особенно метиленовый синий и CuSO₄, показали высокую активность в борьбе против аэромонады и флюоресцентной псевдомонады в концентрациях ниже летальной. Выводы, сделанные в ходе настоящего исследования, окажутся полезными для фермеров, занимающихся рыбным промыслом, для профилактики и лечения бактериальных болезней.

Благодарность

Эту исследовательскую работу проводили в лаборатории USDAProject Департамента генной инженерии и биотехнологии, университете науки и техники, Силхет, Бангладеш, который создан при финансовой поддержке Министерства сельского хозяйства Соединенных Штатов в рамках научно-исследовательского проекта под названием «молекулярное обнаружение бактериальных и грибковых болезней карпа и других рыб, а также лекарственных трав для лечения болезней».

-----

Alam M, Rahman MM, Foysal MJ and Hossain MN. Determination of lethal concentration and antibacterial activity of commonly used disinfectants. International Journal of Natural Sciences (2011), 1(4):102-105